一、背景
破傷風(fēng)( tetanus) 是破傷風(fēng)桿菌侵入人體傷口后，在局部生長繁殖并產(chǎn)生外毒素所致的急性疾病。近年來隨著毒品成癮者越來越多采用注射方式吸毒，且其使用的注射針具可能被多種細(xì)菌污染，乃至因靜脈吸毒者發(fā)生破傷風(fēng)逐年增加，在某些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)和吸毒高發(fā)地區(qū)，甚至已成為破傷風(fēng)的主要傳播途徑。破傷風(fēng)是一種完全可預(yù)防的疾病，由于發(fā)展中國家的免疫不普及，大部分病例發(fā)生在發(fā)展中國家，且由于缺乏有效的治療方法，破傷風(fēng)仍是一種高死亡率的疾病，死亡率為 20 %～ 30%，重癥患者的死亡率可 高達(dá)70 %。而如美國等發(fā)達(dá)國家中亦有較高的發(fā)病率。
因此，破傷風(fēng)仍是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。破傷風(fēng)桿菌在自然界中分布極為廣泛，很多家畜糞便中都帶有破傷風(fēng)桿菌，人糞中也常帶菌。細(xì)菌的芽胞常存在于土壤，污泥和塵埃中。不同類型和大小的傷口均可成為破傷風(fēng)桿菌的入侵門戶。
破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌 ( Clostridium tetani，簡稱為破傷風(fēng)桿菌) 是一種革蘭陽性厭氧芽胞桿菌，是破傷風(fēng)( Tetanus) 的病原菌。它侵入傷口內(nèi)繁殖、分泌內(nèi)毒素且引起急性的特異性感染，主要表現(xiàn)為全身或局部肌肉的持續(xù)性收縮和陣發(fā)性痙攣。1962 年，Latham 開發(fā)出了適合破傷風(fēng)芽胞桿菌生長的半合成培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基含有胰酶消化酪蛋白，至今仍廣泛使用。
二、致病性
破傷風(fēng)桿菌能產(chǎn)生兩種在氨基酸結(jié)構(gòu)上基本相似的外毒素，即 溶血 毒素 ( Hemotoxin)和破傷風(fēng)痙攣毒素( tetanospasmin)。溶血毒素在功能和抗原性與鏈球菌溶血毒類 O 相似，目前此毒素在破傷風(fēng)致病中的作用尚未明確。破傷風(fēng)痙攣毒素是一種蛋白質(zhì)，不耐熱，56 30min即可被破壞。可被腸道中存在的蛋白酶所降解，故口服該毒素?zé)o致病作用。
痙攣毒素在菌體內(nèi)合成時是一條多肽鏈，分子量 160KDa，可在蛋白水解酶作用下裂解成一條輕鏈(分子量為 55KDa)和 一條重鏈 (分子量為105KDa)，兩條肽鏈分開后，各部分的血清學(xué)特性仍存在，但其毒性消失，重新聯(lián)合時又恢復(fù)其毒性。重鏈?zhǔn)嵌舅嘏c神經(jīng)細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷酯結(jié)合部位，輕鏈則具有毒性作用，但必須與重鏈聯(lián)合方能致病。破傷風(fēng)痙攣毒素是由一個大質(zhì)粒編碼，整個毒素基因有 3945 核苷酸，編碼 1315 的氨基酸，其中有一段約 20 個氨基酸部分無毒性作用，是刺激人類 T 細(xì)胞增殖的決定簇。
破傷風(fēng)的發(fā)病機(jī)制是破傷風(fēng)桿菌芽胞進(jìn)入缺氧的創(chuàng)口后，在局部發(fā)芽繁殖產(chǎn)生痙攣毒素，此毒素通過外周神經(jīng)纖維間隙，或通過血液，淋巴液等途徑到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，毒素通過重鏈與脊髓及腦干組織細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞，通過輕鏈的毒性作用抑制突觸未端釋放神經(jīng)介質(zhì)，抑制了正常的調(diào)節(jié)功能，產(chǎn)生特有的破傷風(fēng)臨床表現(xiàn)。
三、培養(yǎng)
傳統(tǒng)的破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，一般含肉類(乳牛心浸液 BHI) 或乳類( 酪蛋白消化液中的 N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR) 制品，其他還有葡萄糖、氨基酸、維生素、尿嘧啶和無機(jī)鹽等。已經(jīng)明，N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR對細(xì)菌生長是必需的。目前使用的干酪素胰酶消化液(胰酪消化液)和胃酶牛肉消化液(濃胨水) 是作為破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基氮源的主要原材料，但是隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，制作一批基礎(chǔ)液已經(jīng)不能保證生產(chǎn)的連續(xù)多批次使用。為解決上述問題，從 2008 年開始將破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基的主要原材料胰酪消化液、濃胨水、豬肝水透析外液用商品化的類似原材料代替。
先保持胰酪消化液、濃胨水和其他組分不變，嘗試應(yīng)用肝浸粉替代豬肝水透析外液，并從培養(yǎng)基制備量小( 60 L)逐步擴(kuò)大到制備量為 120 L、300 L、700 L 各 6 批，通過生化檢測和破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒水平試驗，同時用豬肝水透析外液的培養(yǎng)基接種破傷風(fēng)桿菌的產(chǎn)毒水平進(jìn)行對比，其結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，用肝浸粉可以替代豬肝水透析外液。
接著嘗試應(yīng)用胰酪胨替代胰酪消化液制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基 11 批，試驗產(chǎn)量為 18L，同時以胰酪消化液和濃胨水為基礎(chǔ)液的培養(yǎng)基 540 L，對其生化指標(biāo)質(zhì)量控制和接種破傷風(fēng)桿菌的產(chǎn)毒情況進(jìn)行了比較： 2009 年，用胰酪胨和不同的月示胨作試驗培養(yǎng)基，同時用胰酪消化液和濃胨水為基礎(chǔ)液的培養(yǎng)基 540～670 L，對質(zhì)量控制生化指標(biāo)和細(xì)菌產(chǎn)毒情況進(jìn)行了對比，選擇出一種可用的月示胨以替代原來的濃胨水。
2010 年上半年菌種用培養(yǎng)基沿用傳統(tǒng)的原材料配制，試驗選用胰酪胨和月示胨制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基制備量 54 L 30 批次，同時使用胰酪消化液和濃胨水為基礎(chǔ)液進(jìn)行質(zhì)量控制和破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒水平對比： 2010 年下半年菌種用培養(yǎng)基選用胰酪胨和月示胨，試驗選用胰酪胨和月示胨制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，制備量依次為 36、72、500和 520 L 各 3 批次逐漸擴(kuò)大，檢測培養(yǎng)基的質(zhì)量控制生化指標(biāo)和產(chǎn)毒情況進(jìn)行試驗，完成從小量到大量的原材料替代試驗。
而 2012 年，選用的胰酪胨和月示胨替代傳統(tǒng)自制的胰酪消化液和濃胨水制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，大罐制備量為 500 L 共 48 批次，其培養(yǎng)基檢測的各項生化指標(biāo)穩(wěn)定，產(chǎn)毒能力良好，表明肝浸粉、胰酪胨和月示胨替代傳統(tǒng)原材料制備的培養(yǎng)基易于生化指標(biāo)的質(zhì)量控制，可適用于破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒規(guī)模化的生產(chǎn)。
四、抗菌方法
有實驗構(gòu)建和純化抗破傷風(fēng)桿菌信息菌素（pH-CT），并初步檢測其抗菌活性。從分泌針對破傷風(fēng)桿菌表面抗原的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體可變區(qū)基因序列，利用雙聯(lián)寡核苷酸點突變技術(shù)將抗體模擬物與大腸菌素融合構(gòu)建pH-CT，經(jīng)離子交換柱純化后，通過菌落培養(yǎng)加入不同劑量信息菌素pH-CT（ 終濃度2、4、8、16μg/mL），觀察pH-CT 的體外抗菌活性。通過培養(yǎng)液中接種破傷 風(fēng)桿菌，并加入不同劑量的pH-CT（ 終濃度4、16μg/mL），厭氧培養(yǎng)16h后取濾液及菌液行小鼠腹腔注射，觀察pH-CT 的體內(nèi)抗菌活性。
結(jié)果成功構(gòu)建抗破傷風(fēng)桿菌pH-CT。體外實驗結(jié)果顯示，涂布加入pH-CT2、4μg/mL 孵育菌液的固體培養(yǎng)基上仍見破傷風(fēng)菌落生長，而涂布加入pH-CT8、16μg/mL 孵育菌液的培養(yǎng)基上均無菌落生長；體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，濾液和菌液組中對照組小鼠1d內(nèi)均全部死亡，濾液組pH-CT4、16μg/mL 組小鼠3d內(nèi)全部存活，菌液組中pH-CT４μg/mL組小鼠3d內(nèi)存活3只（50％），pH-CT16μg/mL 組小鼠3d內(nèi)全部存活。因此構(gòu)建的pH-CT在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出對破傷風(fēng)桿菌有抗菌活性，為臨床治療破傷風(fēng)提供了新思路和新途徑，具有應(yīng)用于臨床的潛在價值。
