粗糙脈孢菌順序四分子分析

 一、實(shí)驗(yàn)材料：

粗糙脈孢霉（lys+ 野生型）Neurospora crassa  CCTCC AF 2014012

粗糙脈孢霉（lys- 缺陷型）Neurospora crassa CCTCC AF 2014014

二、粗糙脈孢霉的性質(zhì)與生活史：

粗糙脈孢霉屬于真菌中的子囊菌綱，是低等的真核生物。每一菌絲細(xì)胞中含有幾十個(gè)細(xì)胞核。是遺傳分析好材料:子囊孢子是單倍體，其表型直接反應(yīng)其基因型；一次只分析一個(gè)減數(shù)分裂的產(chǎn)物；體積小，易培養(yǎng)，繁殖快，一次雜交就能產(chǎn)生大量的后代，便于獲得正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果；能進(jìn)行有性生殖，其染色體的結(jié)構(gòu)和功能類似于高等動(dòng)植物；更加重要的是，子囊孢子在子囊中的線性排列順序與減數(shù)分裂中期染色體在赤道板兩側(cè)的排列順序相同，這就是粗糙脈孢霉成為了遺傳分析的好材料。

三、著絲粒作圖與遺傳分析：

利用四分子分析法，測(cè)定基因與著粒間的距離稱為著絲粒作圖。

著絲粒作圖是基于這樣的事實(shí)：減數(shù)分裂中在同源染色體的一對(duì)非姊妹染色單體的著絲粒和某雜合基因座間有沒有發(fā)生交換，和其產(chǎn)物四分子中的等位基因在排列方式上是不同的。可分為兩種：

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 雜交接種與培養(yǎng)：

野生型菌株（Lys+，A）ⅹ缺陷型（Lys-，a）

2. 壓片觀察子囊：（注意觀察時(shí)期）

1）將附有子囊果的濾紙放入裝有來蘇爾溶液的培養(yǎng)皿中

2）取一張載玻片，滴1-2滴來蘇爾，用接種針將子囊果挑出，放在載玻片上

3）蓋上另一張載玻片，用手指壓片，將子囊果壓破

4）顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)各種類型子囊的數(shù)量，每人統(tǒng)計(jì)200個(gè)左右的子囊

教學(xué)建議：

五、教學(xué)建議

粗糙脈孢霉培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）

馬鈴薯浸取液1L

[注] 馬鈴薯浸取液：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1.0升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0升。

葡萄糖20g

瓊脂15g

自然pH

按上述配方配制PDA培養(yǎng)基，也可以通過試劑公司購(gòu)買合成的PDA培養(yǎng)基，按說明書配制。

粗糙脈孢霉雜交培養(yǎng)基

斜面的配制：按比例取用上述培養(yǎng)基，加入瓊脂后需加熱沸騰至瓊脂完全溶解于馬鈴薯浸取液中，然后分裝至試管。試管規(guī)格：18*180，每支試管加入10ml上述瓊脂完全溶解的培養(yǎng)基液體。121度，滅菌20min。滅菌完成后

熱迅速加入100ul賴氨酸(100mg/ml)溶液至每支試管，混勻后擺制斜面。

賴氨酸溶液的配制方法：取0.5g賴氨酸粉末溶解于5ml無菌水中,待完全溶解后取0.22um孔徑的過濾器進(jìn)行過濾除菌后備用。

最佳保存條件：不用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，可于室溫保存2周左右。