細(xì)胞特性
1）來源：人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞
2）形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞
3）含量：>1x106 個/mL
4）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性
5）規(guī)格：T25 瓶或者 1mL 凍存管包裝
運輸和保存：可選擇干冰運輸及發(fā)送復(fù)蘇存活
細(xì)胞方式：（1）干冰運輸，收到 后立即轉(zhuǎn)入液氮或者-80 度冰箱凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活
細(xì)胞，收到后應(yīng)繼 續(xù)生長，傳代達(dá)到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。 收到細(xì)胞后請拍照，3 天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請及時拍照與我們聯(lián)系。
細(xì)胞接收后的處理： 1）收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。 2）請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，酒精消毒瓶壁并將 T25 瓶置于 37℃培養(yǎng) 約 2-3h。 3）棄去 T25 瓶中的培養(yǎng)基，添加 6ml 新的完全培養(yǎng)基。 4）如果細(xì)胞長滿 80%-90%請及時進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代培養(yǎng)用本公司附帶的完全 培養(yǎng)基。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備： 1）準(zhǔn)備內(nèi)皮專用培養(yǎng)基 2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕 度為 70%-80%。 3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
二．
細(xì)胞處理： 1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。 2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。 2.加 2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培養(yǎng)箱 中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。 3.按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘， 棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。 4.將細(xì)胞懸液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）
細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。 下面以 T25 瓶為例； 1．細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗瓶底 1-2 次后加入 1ml 胰酶， 細(xì)胞變圓脫落后，加入 2ml 完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。 2．1000RPM 離心 4 分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加 DMSO 至最終濃度為 10%。加入 DMSO 后迅速混勻，按每 1ml 的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好 標(biāo)識。本公司按每個凍存管
細(xì)胞數(shù)目大于 1X106 個細(xì)胞凍存。 3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 個小時以后轉(zhuǎn) 入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。 注意事項： 1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及
細(xì)胞有污染，請立 即與我們聯(lián)系。 2. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注 意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
